Njegovi roditelji John Marshall i Jane (rođ. Lampton) imali su sedmero djece od koje je budući poznati pisac bio šesto dijete. Kada je Twainu bilo četiri godine obitelj se seli u rječnu luku Hannibal na obalama rijeke Mississipi. U Hannibalu je pohađao osnovnu školu. Kada je Twainu bilo 11 godina (1847.) njegov otac umire od upala pluća. Poslije očeve smrti pohađati će tiskarski zanat. Po svršenom zanatskom školovanju kao slovoslagač i humorist radi za list Hannibal Journal koji je u vlasništvu njegova brata Oriona. Svoje tekstove tada potpisuje pseudonimom Josh.

Napunivši 18 godina odlazi iz bratove tvrtke i radi kao tiskar u Keokuku (Iowa), New York Citiyu, Philadelphiji, St. Louisu i Cincinnatiju. Mijenja radna mjesta, ali redovito uvečer posjećuje knjižnice. S napunjene 22 godine vraća se u Missouri. Na putovanju za New Orleans niz rijeku Mississipi kormilar Horace E. Bixpy budi u njemu želju da postane kormilar na parnom brodu. No, prije nego dobije plovnu dozvolu (1859.) dvije će godine proučavati tok rijeke Mississipi. Trenirajući nagovara brata Henrya da mu se pridruži. No, Henry će poginuti (21. lipnja 1858.) pri eksploziji na brodu Pennsylvania. Njegovu će smrt Twain predvidjeti u svom snu mjesec dana ranije što će ga potom nagnati da se zainteresira za parapshilogiju. Do kraja života Twain će sebe kriviti za bratovu smrt, a kao kormilar raditi će sve do početka američkog građanskog rata (1861.) kada će se zbog rata promet rijekom smanjio. Sa skupinom prijatelja kao dragovoljac pridružiti će se konjaništvu Konfederacije (1861.), ali će njihova postrojba nakon dva tjedna biti raspuštena.

Kasnije iste godine (1861.) pridružit će se bratu Orionu u novoosnovanoj teritoriji Neveda gdje će kao rudar raditi u rudniku srebra. Vidjeviši da posao rudara nije za njega postaje izvjestitelj lista Territorial Enterprise (Virginia City, Nevada). Od tada (3. veljače 1863.) počinje koristiti pseudonim Mark Twain što je na rijeci Mississipi fraza koja znači "dva hvata duboko". No, seriju svojih humorističnih pisama potpisati će pseudonimom Thomas Jefferson Snodgrass. Uskoro seli u San Francisco (1854.) gdje i dalje radi kao novinar te susreće pisce Artemusa Warda, Breta Hartea i Dana DeQuillea koji ga podupiru u njegovu spisateljskom radu. Prvi spisateljski uspjeh postiže s humorističnom bajkom koju je čuo na kalifornijskim zlatnim poljima, preradio i potom objavio pod naslovom The Celebrated Jumping Frog of Calaveras County. Djelo je objavljeno 18. studenog 1865. u listu New York Saturday Press i donijelo mu prvu slavu. Uskoro putuje na Havaje kao reporter lista Sacramento Union. Dvije godine kasnije (1867.) putuje u Europu i Palestinu. Ta će putovanja opisati u knjizi The Innocents Abroad(1869.) u kojoj će preuveličati europsku kulturu koja se i inače veoma dojmi američke turiste.

Sa svojom budućom suprugom Olivijom Langdon upoznaje se 1868. i njih dvoje zaljubljuju se na prvi pogled. Naredne se godine zaručuju, a vjenačavaju se u veljači 1870. u mjestu Elmira (New York). Olivija je bila iz bogate liberalne obitelji koja je podržavala abolicioniste te borbu za socijalnu jednakost i ženska prava. Mladi je bračni par živio u gradiću Buffalo (New York) gdje je Twain radio za list Buffalo Express kao urednik i pisac. Oboljevši od difterij u dobi od 19 mjeseci umire njihov sin Langdon. Kasnije će na svijet doći Susy (1872.), Clara (1874.) i Jean (1880.). Obitelj se potom seli u Hartfored (Connecticut) i tu ostaje do 1891. Twain tu piše neke od svojih najslavnijih djela. U The Adventures of Tom Sawyer (Pustolovine Toma Sawyera) slavi djetinjstvo u gradu na obali rijeke Mississipi. The Prince and the Pauper dječija je knjiga usredotočena na zamijenu identiteta u tudorskoj Engleskoj. Tlačenje ljudi u feudlanoj Engleskoj prikazuje u satiri Yankee in King Arthur's Court (Yankee na dvoru kralja Arthura) dok u Life on the Mississippi kombinira autobiografski prikaz vlastitih iskustava kao rječnog pilota. Tu piše i nastavak Toma Sawyera nazvan The Adventures of Huckleberry Finn. Taj se uradak smatra njegovim najboljim djelom. U knjizi je riječ o dječaku zvanom Huck koji bježi od svoga oca na splavi rijekom Mississipi s odbjeglim robom Jimom. Ovo djelo, između ostalog, daje čitatelju sliku života na rijeci Mississipi prije američkog građanskog rata. Svoje drugo putovanje u Europu opisao je u knjizi A Tramp Abroad gdje naglasak stavlja na svoje putovanje kroz Schwarzwald.

Tvrtku Charles L. Webster and Company osniva 1884. kakao bi lakše objavljivao svoja djela, ali i uratke drugih pisaca. Najpoznatije djelo koje je ta tvrtka objavila bili su Osobni memoari (dva sveska, 1885.-1886.) koje je napisao američki general i predsjednik Ulysses S. Grant. Loša investicija u automatski pisaći stroj dovela je tvrtku do bankrota (1894.). Međutim, uspješna predavanja širom svijeta i knjiga koja je nastala na osnovu tih putovanja (Following the Equator) otplatili su dugove. Twainov rad koncem 19. i početkom 20. stoljeća označen je rastućim pesimizmom i gorčinomkoje je prouzročio njegov poslovni neuspjeh, a kasnije i smrt njegove supruge (1904.) te dvije kćerke (Susy 1872. i Clara 1874.). U to vrijeme piše novelu Pudd'nhead Wilson radnja koje je smještena na američki jug prije građanskog rata i u kojoj kritizira rasizam. Potom piše sentimentalnu biografiju Recollections of Joan of Arc da bi niz nastavio s filozofskim, socijalnim i političkim esejima (The Man That Corrupted Hadleyburg i The War Prayer). Nekompletni rukopis djela The Mysterious Strange objavljen je postuhumno 1916.

U djelu The War Prayer iznio je svoj stav o filipinsko-američkom ratu, ali je njegov nakladnik Harper's Bazaar odbio objaviti ova esej. Podržao je i revoluciju u Rusiji govoreći kako car mora biti svrgnut na nasilan način jer miran način nije dao rezultate. Podupirao je ukidanje ropstva te bio aktivni zagovornik ženskih prava. Njegov govor Votes for Women, u kojem se zalaže za davanje prava glasa ženama, smatra se jednim od najčuvenijih govora u povijesti. Svoju je potporu davao i radničkom pokretu, posebice sindikatu Knights of Labor (Vitezovi rada). Bio je opčinjen znanošću i njezinim dostignućima te je njegovao prijateljstvo s Nikolom Teslom. Njih su dvojica mnogo vremena provodili zajedno u Teslinu laboratoriju. Tijekom tih druženja i sam Twain je osmislio neke izume od kojih je neke i patentirao.

Twainov je rad inspirairan nekonvencionalnim Zapadom, a popularnost njegovih djela označila je u američkoj literaturi kraj dominacije pisaca iz Nove Engleske. Kasniji slavni američki pisci Ernest Hemingway i William Faulkner pozivali su se na Twaina kao na svoju inspiraciju. U posljednjim godinama svog života pisao je manje, ali je često javno govorio o mnogim temama. Ostao je zapamćen i po odijelima s bijelim crtama koja je uvijek nosio u javnim nastupima. O njegovu ugledu rječito govori i podatak da je 1907. primio počasni doktorat Oxfordskog sveučilišta. Za sobom je ostavio nedovršenu autobiografiju koju je 1924. objavila njegova tajnica Alberta Bigelow Paine. Početkom 1990. pronađen je izvorni rukopis romana The Adventures of Huckleberry Finn u Hollywoodu. Nakon duljeg povlačenja po sudu oko borbe za prava vlasništva taj je rukopis (kao i drugi do sada neobjavljeni materijali) dodjeljen njujorškoj Javnoj knjižnici Bufffalo & Erie Couny (1992.). Četiri godine nakon pronalaska (1996.) objavljeno je revidirano izdanje romana The Adventures of Huckleberry Finn zajedno s do sada neobjavljenim materijalima.

Godinu dana prije smrti (1909.) rekao je: "Došao sam s Halleyvim kometom 1835. Opet dolazi naredne godine i očekujem da odem s njim. Bilo bi to veliko razočarenje u mom životu da ne odem s Halleyvim kometom. Siguran sam da je Svemoćni rekao: Ovo su dva neuračuljiva čudaka; zajedno su došli, zajedno moraju otići." Njegovo predviđanje bilo je točno - preminuo je 21. travnja 1910. u mjestu Redding (Connecticut), jedan dan nakon što se komet maksimalno približio Zemlji. Sahranjen je na imanju svoje supruge u gradiću Elmira (New York).

Najpoznatija djela:
The Adventures of Tom Sawyer (Pustolovine Toma Sawyera, 1876.)
A Tramp Abroad (1880.)
Pauper (1882.)
The Adventures of Huckleberry Finn (1884.)
Yankee in King Arthur's Court (Yankee na dvoru kralja Arthura, 1889.)
Pudd'nhead Wilson (1894.)
Recollections of Joan of Arc (1896.) 
Following the Equator (1897.)
The Man That Corrupted Hadleyburg (1899.) 
The War Prayer (1905.)